2 基因与基因工程¶
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2.1 基因的发现¶
孟德尔豌豆杂交实验
摩尔根的果蝇杂交实验：确定了基因在染色体上作直线排列，基因间的相对距离可以通过杂交实验的交换值来测定
麦克林托克的玉米杂交实验：基因可以“跳跃” —— 转座理论
2.2 基因是什么¶
1977 年，美国科学家理察·罗伯茨和菲利普·夏普两个实验室，同时发现了内含子
真核生物的基因：断裂基因。由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成
基因是原核、真核生物以及病毒的 DNA 或 RNA 分子中一段或多段具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制性状的功能单位
基因的类型：
- 转录、翻译的：结构基因
- 转录不翻译的：编码 rRNA 的基因
- 不转录也不翻译的：操纵基因
- 不连续编码的：断裂基因
- 可以转移位置的：转座子
- 基因编码区有重叠的：重叠基因
2.3 基因的遗传¶
遗传的中心法则：
基因与性状¶
生物的形状是由基因与环境共同作用的结果
- 显性基因 → 显性性状
- 隐性基因 → 隐性性状
- 致死基因 → 致死作用
单基因遗传¶
- 常染色体显性遗传病
- 常染色体隐性遗传病
- x 连锁显性遗传病
- x 连锁隐性遗传病
- Y 连锁遗传（限雄遗传）
多基因遗传¶
数量性状：
- 生物性状的变异在一个群体中是连续的
- 数量性状是由多基因和环境共同作用的
多基因决定的数量性状的评价 —— 遗传率
环境引起的变异一般只表现于当代，不能连续，遗传变异是可以遗传的。遗传变异对数量性状的作用，用遗传率来表示：
遗传率高说明群体的变异主要是由遗传变异引起的
表观遗传¶
- 用进废退：生物体的器官用则进化，不用就退化
- 获得性遗传：生物后天获得的性状是可以遗传的
表观遗传：
不基于 DNA 差异的核酸遗传，即细胞分裂过程中，DNA 序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传
表观遗传学：
研究不涉及 DNA 序列改变的基因表达和调控的可遗传变化的，或者说是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支
机理¶
- DNA 甲基化：DNA 甲基化是表观遗传变异的重要方式之一。在 DNA 甲基化转移酶的作用下，使 CpG 的胞嘧啶甲基化，基因表达水平与甲基化呈负相关
- 组蛋白修饰：组蛋白与 DNA 结合，可降低 DNA 的转录活性，组蛋白上有许多信号位点，常被修饰而影响染色体的高级结构和基因的转录调控
乙酰化：可逆，正调控
磷酸化：可逆/正调控
甲基化：不可逆，负调控 - 染色质重塑：染色质重塑复合物、组蛋白修饰酶的突变和转录调控、DNA 甲基化、DNA 重组、细胞周期、DNA 的复制和修复的异常相关
近亲繁殖与杂种优势¶
近交系数：一个个体从某一祖先得到一对纯和的、而且遗传上是等同的基因的概率
杂种优势：选择有利于杂合子的程度大于两种纯合子
杂种优势理论：
- 显性学说
- 超显性学说
2.4 遗传物质的改变¶
2.4.1 基因突变¶
生物个体 DNA 序列发生的改变。通常，基因以及基因调控序列的改变可能会引起生物性状的 改变。DNA 碱基的缺失、插入、替换、移码等序列的改变，都可能引起基因的突变
2.4.2 染色体畸变¶
染色体畸变是指生物细胞中染色体在数目和结构上发生的变异。染色体结构变异包括缺失、重复、倒位、易位等
染色体结构变异¶
缺失是指染色体的片段出现丢失
染色体缺失通常会影响个体的生活力。缺失纯合体的生活力比缺失杂合体的生活力更低
猫叫综合征：5 号染色体断臂缺失
重复是指染色体的部分区段出现多个拷贝
对个体的影响相对缺失较为缓和，但大段的重复也会影响生活力
起源于同源染色体之间的断裂和错误重接，或染色单体之间的不等交换等。
果蝇的棒眼基因
倒位是指染色体一个区段发生了 180° 的颠倒
多数情况下到位携带者的表型相对正常
血友病
易位是指染色体片段的位置转移
多数情况下易位携带者的表型相对正常
易位通常起源于两条非同源染色体的断裂和错误连接
慢性髓系白血病
染色体数目变异¶
任一生物的染色体数目都是恒定的。染色体数目的变异与结构变异一样，也是染色体畸变的重要组成部分
- 一个配子内的全部染色体构成一套完整的染色体组。体细胞内染色体数目是染色体组整数倍的生物个体被称为整倍体
- 大多数生物含有两套完整的染色体组，是二倍体。只含有单套染色体组的细胞核型 称为单倍体。含有超过两套染色体组的细胞核型称为多倍体
单倍体生物：
单倍体生物的细胞内只存在单套染色体
一些低等植物的配子体和一些膜翅目昆虫的雄体是天然的单倍体。如雄蜂是由未受 精的卵细胞经孤雌生殖发育而来的
多倍体生物：
多倍化和杂交是高等植物基因组进化和新物种形成的主要动力之一
约 70％ 的被子植物的种内具有多倍体。多倍体植物在栽培作物、果树、蔬菜中尤为常见
动物中罕见多倍体。多倍体动物如绿蟾蜍（四倍体）、牡蛎（三倍体）、九孔鲍（三倍体）等
多倍体可以根据起源的机制不同分为同源多倍体和异源多倍体
无籽西瓜：
- 二倍体西瓜（2n=22）在幼苗期用秋水仙碱处理，得到四倍体西瓜（2n=44）
- 将四倍体西瓜作为母本，二倍体西瓜作为父本，可以在四倍体西瓜上结出三倍体的种子（3n=33）
- 三倍体种子种植下去后长出三倍体植株来
- 用二倍体植物的花粉刺激，在三倍体植株上才能有无籽西瓜的发育
非整倍体与人类疾病：
染色体畸变，尤其是非整倍体变异，是造成人类胚胎自然流产和新生儿出生缺陷的主要原因
在出生缺陷的新生儿中，仅可见 3 种常染色体三体（13 三体、18 三体和 21 三体）和性染色体的非整倍体，还有少量结构变异
21 三体综合征
2.5 生物性别决定¶
生物的性别决定是指有性生殖生物中决定雌、雄性别分化的机制
不同的生物，性别决定的方式虽然不尽相同，但可以分为遗传决定和环境决定这两种主要的类型
一些生物的个体，性别在一定的条件下还会发生转换
染色体决定性别¶
- XY 型：人类，哺乳动物，果蝇
- ZW 型：鸟类，蝴蝶
- XO 型：雄性只有 X 染色体，没有 Y 染色体。蝗虫（雄性为 X，雌性为 XX）
染色体倍数决定性别¶
蜜蜂的蜂王和工蜂是二倍体，而雄峰是由蜂王未受精的卵发育而来的单倍体。雄性配子与蜂王的雄配子结合，形成二倍体，在不同营养条件下，发育为蜂王和工蜂
基因决定性别¶
玉米雌雄同株：
- 雌花序由 Ba 基因控制
- 雄花序由 Ts 基因控制
环境决定性别¶
温度性别决定型
很多爬行类动物（鳄目、龟鳖目、有鳞目）都属于温度决定性别类型。这些爬行类动物没有性染色体/性别分化属于温度性别决定型
胚胎孵化性别分化温度敏感期：受精卵发育初始的 4，5天。开始进入性别器官分化期间，温度起到性别分化的决定作用
- 雄性促进温度
- 雌性促进温度
性反转¶
生物个体性别发生的转换现象
黄鳝，合鳃目，染色体2n=24。黄鳝的发育阶段有不同性别状态，产生性反转。2+ 龄前 皆为雌性，3+ 龄转变为雌雄同体，卵巢逐渐退化，精巢逐渐形成。6+ 龄全部反转为雄性
珊瑚岛鱼，在 30、40 条左右的群体中，只有一条为雄性，当雄性死后，由一条强壮的雌性转变为雄性
2.6 人类的性别畸形¶
性染色体¶
- Klinerfelter 综合征：外貌男性，睾丸萎缩，具有乳房，不育，低智商，47，XXY
- XYY 综合征：外貌男性，智力一般较低，性格粗暴，易冲动，生殖器官发育不良，多数不育，反社会行为，两条或两条以上 Y 染色体
- Turner 综合征：外貌女性，个矮，第二性征发育不良，原发性闭经，肘外翻，盾状胸，往往有先天性心脏病，智力低下或正常，染色体组成是 45，XO
- 真两性畸形：一侧睾丸一侧卵巢，第二性征介于两性之间，46，XY/XX
- 多 X 女性：变现为女性，眼距宽，外生殖器及第二性征多正常，有的月经失调，类似 21 三体，智力发育迟缓，具有两条以上的 X 染色体
SRY 基因¶
- 女性阴阳人：具有正常女性的染色体组成，外观男性
- 男性阴阳人：具有正常男性的染色体组成，外观多呈女性
临床上还发现一些 XY 个体有正常 SRY 基因，但无睾丸而有卵巢，另一些 XX 个体，无 SRY 基因，确有睾丸无卵巢。为什么
原因是 SRY 基因只是性别决定的开关，通过转录调控其他基因表达而使性腺原基向睾丸组织分化。SRY 的下游还有一系列基因参与到性腺的分化调控中，这些基因发生突变，有时会影响到性别的分化，导致性别畸形
2.7 人类的性别认同和性取向¶
人类生殖器官的性别分化
男性 Y 染色体的性别决定区域基因（SRY）导致性腺分化为睾丸，睾丸产生睾酮，和受体结合起反应，使机体发育雄性化
没有睾酮的条件下，发育沿着雌性模式进行
生殖器官的性别分化在发育的早期即已发生（即在怀孕的最初两个月）比大脑的性分化（在妊娠期的后半阶段才开始，并在抵达成年时变得明显）要早很多
这两个过程可以相对独立、受到不同因素的影响
- “程序化”或者“组织化”效应（永久性调节）
- “激活“效应（短暂性调节）
大脑的程序化效应：例如，性别认同具有永久性的特征
人类大脑早期程序化效应不可能被改变：例如，同性恋
差异存在于大脑
2.8 重组 DNA 技术¶
基因工程的基本内容：
- 获得目的基因，并与载体连接成重组 DNA 分子
- 重组 DNA 分子导入受体细胞
- 筛选重组克隆，扩增或表达
- 经过基因改造的细胞或生物体，基础研究及各种应用
1972 年，Paul Berg 等人构建了世界上第一个重组 DNA 分子
1973 年，Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 创造了第一个重组 DNA 生物 —— 转化了重组质粒 DNA 的大肠杆菌
1976 年，Herbert Boyer 与投资人 Robert Swanson 成立了全球第一家生物技术公司— Genentech
1978 年开发了使用重组DNA技术合成人胰岛素的方法
目的基因的获得¶
获得目的基因的方法主要有以下三种途径： 1. 构建基因文库或cDNA文库，从中调用目的基因 2. 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段 3. 人工合成核苷酸链：通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因
PCR 技术
聚合酶链式反应（PCR），是一种体外扩增 DNA 片段的分子生物学技术 —— 以微量DNA为模板，快速复制出大量DNA拷贝
1983年由 KaryB.Mullis 博士提出PCR概念，1985年在Science发表第一篇PCR的学术论文（镰刀型贫血症的诊断）
PCR 反应的试剂：
- 模板：待扩增的 DNA 片段
- 引物：一对与待扩增的 DNA 片段两侧互补的人工合成寡核苷酸链，一般 20~25 bp
- 底物：4 种dNTP（含不同碱基的三磷酸脱氧核苷酸）
- 耐高温的 DNA 聚合酶，如 Taq 聚合酶
- 包含 \(Mg^{2+}\) 在内的合适的缓冲体系
PCR 反应的过程：
- 变性：高温（94~98℃）条件下，模板 DNA 双链解离成为单链
- 退火或复性：温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对
- 延伸或合成：加热至 DNA 聚合酶的最适温度，DNA 模板 - 引物复合物在聚合酶作用下，以四种 dNTP 为反应原料，沿单链模板以 5'-3' 方向，按碱基互补配对原则，合成一条新的 DNA 单链
载体¶
将外源基因通过 DNA 重组技术和微生物转化等方法送进受体细胞并在其中复制或表达的运载工具
类型：
- 质粒和柯斯质粒
- 病毒载体
- 噬菌体
- 腺病毒
- 腺相关病毒 AAV
- 慢病毒 Lentivirus 载体等
- 人工染色体
质粒一般为双链闭环的 DNA 分子，独立于染色体外，具有自主复制和转录能力。大小在 1~200 Kb 之间，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中
限制性内切酶：
发现源于细菌防御菌体感染的保护机制
DNA 限制性内切酶可以识别并附着特定的 DNA 序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的
Ⅱ型限制性内切酶：切割位点位于识别序列之内或附近，识别序列长度通常为 4-8bp 的回文序列。酶切之后会形成粘性末端（5'或3'突出端）和平末端
DNA 连接酶：
DNA连接酶：可连接DNA链3'-OH末端和另一DNA链的5'P末端，形成磷酸二酯键，从而“缝合”两段具有相同黏性末端的DNA链
新型克隆方法¶
“酶切·连接”DNA重组的技术瓶颈：
- 依赖于合适的限制性内切酶位点
- 平末端连接的效率较低
- 多个片段的定向连接需要巧妙设计和高超技术
有无更简单、更高效的方法？
大自然是如何进行DNA重组的昵？
- 利用大肠杆菌或酵母体内的同源重组体系
- 不依赖于序列和连接的克隆
2.9 转基因技术及其应用¶
逆转录病毒，农杆菌侵染植物，甘薯是天然的转基因作物，微生物转化
基因工程改造大肠杆菌合成人胰岛素
酿酒酵母制备乙肝疫苗：世界上第一个重组疫苗
动物转基因技术¶
细胞转染
- 化学方法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法等
- 物理方法：显微注射、电穿孔、基因枪法等
- 病毒感染：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒 AAV 等载体
应用：
基础研究
- 基因的功能与调控机制
- 肿瘤发生、免疫反应、发育、遗传疾病的分子机理
建立人类疾病的动物模型：原癌小鼠
生产医用蛋白
植物转基因及应用¶
土壤农杆菌，Ti 质粒上的 T-DNA，可插入外源目的基因，再侵染植物
利用植物细胞的全能性得到转基因植株，短期内完成定向育种
土壤农杆菌不侵染某些植物，可使用拟南芥浸花法
基因枪法：把 DNA 包裹在金粉或钨粉上制成“子弹“，通过高压氦气使其获得一个很高的速度（300、600m/s），穿过植物细胞。DNA 会有一部分留在植物细胞中，以一种目前不清楚的机制整合进植物细胞染色体
花粉管通道法
PEG 介导的原生质体转化
2.10 基因编辑技术¶
三大利器：ZFN/锌指核酸酶，Cas核酸酶，TALEN/转录激活因子样效应核酸酶
CRISPR：成簇规律间隔短回文重复
应用¶
- 生命科学基础研究
- 精准基因治疗与药物开发
- 动植物遗传育种与改良
- 生物能源与材料
基因驱动：
基因驱动技术能够快速将特定性状扩散到群体中
利用CRISPR基因编辑技术，通过供体模板在特定的切割位点插入新基因
- 利：可根除蚊媒疾病，消灭或控制入侵物种等
- 弊：极大隐患，影响生态平衡，制造生物武器等
问题与挑战¶
准确性与安全性：
提升编辑效率的同时，规避脱靶效应
建立安全有效的检测手段，检测靶位点序列变化以及是否造成未知突变
开发可靠的基因递送系统，安全、高效、准确地释放到目标组织或细胞
减弱细胞毒性
双刃剑 —— 避免技术的滥用
- 基因武器
- 基因歧视
2.11 基因治疗¶
思路：
- 用健康的基因取代致病的基因
- 失活或敲除功能不正常的突变基因
- 向体内引入新的或修饰过的基因
- 以 RNA 为靶点
- 转基因：缺啥补啥
- 基因编辑：定位 + 纠正
基因的递送方式：
- 病毒载体：如腺相关病毒 AAV 和慢病毒 Lentivirus
缺点：粗黁在病毒毒性、免疫原性等潜在风险 - 非病毒载体：脂质体、纳米颗粒等
缺点：低转染效率、使用的细胞类型有限
物理方法：电转导、基因枪、显微注射等
基因治疗模式
- 离体治疗：取出细胞改造基因，体外培养扩增，输回体内。改造 T 细胞核造血干细胞
- 体内治疗：直接把健康基因/基因编辑工具转入目标组织/细胞。神经系统疾病、血友病、肌肉疾病、视网膜病变等
思考题¶
-
如何解释拉马克“用进废退、获得性遗传”的演化理论？
-
用进废退：生物体的器官用则进化，不用就退化
- 获得性遗传：生物后天获得的性状是可以遗传的
- SRY基因在人类性别分化中有何作用？
男性 Y 染色体的性别决定区域基因（SRY）导致性腺分化为睾丸，睾丸产生睾酮，和受体结合起反应，使机体发育雄性化
SRY 基因只是性别决定的开关，通过转录调控其他基因表达而使性腺原基向睾丸组织分化。SRY 的下游还有一系列基因参与到性腺的分化调控中，这些基因发生突变，有时会影响到性别的分化，导致性别畸形
- 简述基因工程操作的主要步骤和实践意义
基因工程是一种通过直接操作有机体的基因组，以改变其遗传物质或表达特定基因的技术。这项技术在医学、农业、工业等多个领域有着广泛的应用。以下是基因工程操作的主要步骤和实践意义：
基因工程操作的主要步骤
- 目标基因的选择与分离：
- 确定需要插入宿主细胞的目标基因。
-
使用限制性内切酶从供体DNA中切割出目标基因片段。
-
载体的选择与构建：
- 选择适当的载体（如质粒、噬菌体、病毒等），用于携带目标基因进入宿主细胞。
-
将目标基因插入到载体的适当位置，形成重组DNA分子。
-
转化/转导/转染：
-
将重组DNA引入宿主细胞的过程称为转化（对于细菌）、转导（对于病毒）或转染（对于真核细胞）。
-
筛选与鉴定：
- 通过标记基因或其他方法筛选出成功导入了重组DNA的宿主细胞。
-
验证目标基因是否正确整合，并能够正常表达。
-
表达与纯化：
- 在合适的条件下培养转化后的细胞，使目标基因得以表达。
-
收集并纯化由目标基因编码的蛋白质产物。
-
功能验证：
- 测试所获得的基因产品是否具有预期的功能特性。
实践意义
- 医药健康领域：
- 开发新型疫苗和治疗药物，例如利用基因工程技术生产单克隆抗体、胰岛素等人用药物。
-
治疗遗传性疾病，通过基因疗法修正缺陷基因。
-
农业领域：
- 提高作物抗病虫害能力、耐逆境能力和产量；改善农产品品质。
-
创造转基因动物，提高农业生产效率。
-
环境保护：
-
利用基因改造微生物降解环境污染物，促进生态修复。
-
基础科学研究：
- 探索生命科学的基本原理，如基因表达调控机制、信号传导路径等。
- 构建生物模型系统，加速对复杂生物学过程的理解。
总之，基因工程是一项强大的工具，它不仅推动了科学技术的发展，也深刻地影响着人类的生活质量和地球的生态环境。随着技术的进步，基因工程将继续在多个方面发挥重要作用。
- 公众转基因争论的核心是什么？如何评估转基因植物的安全性？
公众对转基因争论的核心主要集中在以下几个方面：
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安全性问题：公众担心转基因植物及其产品是否对人体健康有害，例如是否会引发过敏反应或毒性作用。此外，还存在对于转基因作物中基因漂移的担忧，即外源基因可能会转移到野生植物或杂草中，造成超级杂草等问题。
-
环境影响：人们关心转基因植物释放到环境中后可能带来的长期生态效应，包括对本地物种多样性的潜在威胁、生态系统平衡的影响等。
-
伦理与道德考量：一些人认为人为改变生物的遗传物质违背自然规律，涉及到伦理和道德层面的问题。
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经济和社会因素：部分群体担心大公司控制种子市场，导致农民依赖性和成本增加；还有关于知识产权保护以及小农户利益受损等方面的顾虑。
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信息透明度和知情权：消费者希望了解他们所购买食品的真实成分，并有权选择是否消费含有转基因成分的产品。
为了科学地评估转基因植物的安全性，通常采取以下措施：
-
风险评估框架：建立一个基于科学的风险评估体系，该体系应考虑转基因植物的环境安全性和食品安全性。这需要遵循实质等同原则（Substantial Equivalence），即比较转基因植物与其非转基因对照品之间的差异。
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详细的实验设计：进行严格的实验室测试，以确定新引入的基因产物是否具有毒理学特性或引起过敏反应。这些测试可以包括急性毒性试验、慢性毒性试验、致突变性分析等。
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环境释放前的田间试验：在严格监控下开展田间试验，观察转基因植物在其生长环境中的行为，特别是它们与其他植物、昆虫和其他生物互动的情况。
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多学科合作：涉及生态学、毒理学、营养学等多个领域的专家共同参与评估过程，确保评估结果全面准确。
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持续监测：一旦转基因植物被批准商业化种植，就需要对其进行长期跟踪监测，收集数据并及时调整管理策略。
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法规遵从：遵守国家和国际上有关转基因生物安全管理的规定，如中国农业部发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》等文件的要求。
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透明沟通：政府机构、科研单位及企业应该积极向公众传达正确的科学知识，提高信息透明度，增强消费者的信任感。
综上所述，评估转基因植物的安全性是一个复杂的过程，它不仅依赖于科学研究和技术手段的应用，还需要政策制定者、科学家和公众之间的良好沟通与合作。
- 如何理解合成生物学的层级结构与设计原理？